實驗摘要

重組藻膽色素可作為一種較安全、可替代的藥品應(yīng)用于器官移植、抗炎癥等方面的治療領(lǐng)域。目前利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組藻膽色素制備工藝相對簡單、成本相對較低，具有大規(guī)模制備的潛在價值。本研究利用多基因組合表達技術(shù)，以大腸桿菌體內(nèi)血紅素為底物，通過外源導(dǎo)入含有hox1和pcyA基因的不同表達載體，在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建藻膽素的生物合成途徑，從而用于重組藻膽色素的規(guī)模制備。

實驗所需材料與方法

1.實驗原理

由于光合作用，藻類進化出了具有特定結(jié)構(gòu)和功能的捕光天線系統(tǒng)，以紅藍藻為主的藻膽蛋白體系。藻膽蛋白是由藻膽色素與相應(yīng)的脫輔基蛋白共價結(jié)合形成的，主要存在于藍藻、紅藻等細胞內(nèi)，在光合作用過程中起到吸收和傳遞能量的作用。

藻膽色素是一類線性四吡咯化合物（分子量約600Da）。藻膽體中一般含有300～800個共價偶聯(lián)的藻膽色素。與藍藻藻膽蛋白結(jié)合的色素有4種。這四種色素分別是：藻紅膽素（phycoerythrobilin，簡稱PEB）主要存在于PE中，藻藍膽素（phycocyanobilin，簡稱PCB）主要存在于PC，APC和PEC中，藻尿膽素（phycourobilin，簡稱PUB）主要存在于B-PE和R-PE中，藻紫膽素（phycoviolobilin，簡稱PVB）僅存在于PEC中。這四種色素互為同分異構(gòu)體，它們的差異表現(xiàn)在雙鍵的位置和數(shù)目，從而導(dǎo)致不同藻膽色素間吸收波長的差異。它們可以高效地吸收紅光、綠光等葉綠素a（葉綠素a，Chla）吸收較差的光區(qū)，為藻類的新陳代謝活動發(fā)揮著重要作用。

 以大腸桿菌體內(nèi)血紅素為底物，通過外源導(dǎo)入含有hox1和pcyA基因的不同表達載體，從而在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建藻膽色素的生物合成途徑。

藻膽色素生物合成途徑

2.藻膽色素的檢測與定量方法

采用紫外分光光度計及熒光分光光度計對其進行檢測和定量。藻膽色素具有共軛雙鍵體系，極易發(fā)生 π→π*，n→π*電子躍遷，因此可以利用熒光技術(shù)手段對其中的藻藍膽素和藻紅膽素進行檢測。此外，藻藍膽素和藻紅膽素在特定的溶液中具有特定的吸收峰，從而可以根據(jù)吸收峰的位置及吸光度對其定性、定量分析。

實驗操作步驟如下：

（1） 藻藍膽素的粗提：取 100 mL 的菌液，8000 g，離心 10 min 收集菌體。所得的菌體用 40 mL 甲醇在 50°C 條件下，水浴加熱 1~2 h，至菌體沉淀呈白色，8000 g，離心，10 min 取上清待用;

（2） 特征吸收峰的測定：（1）中所得的藻藍膽素的甲醇溶液加入適量的濃鹽酸（VCH3OH：VHCl=95：5），測其紫外可見光吸收曲線;

（3） 樣品濃度的計算：c（mM）=A680/37.9×稀釋倍數(shù);

④ ①中藻藍膽素的甲醇溶液，測其紫外可見光吸收曲線，并根據(jù)吸收曲線測定其熒光發(fā)射光譜。

可見光波長范圍：390~760納米。

紅光：波長范圍：760~622納米；

橙光：波長范圍：622~597納米；

黃光：波長范圍：597~577納米；

綠光：波長范圍：577~492納米；

青光：波長范圍：492~450納米；

藍光：波長范圍：450~435納米；

紫光：波長范圍：435~390納米。

3.實驗用品

3.1.材料：菌種（大腸桿菌，BL21）

3.2．器材和儀器：精準天平、紫外分光光度計、熒光光譜儀、pH計、紫外檢測儀、高速離心機、低溫恒溫槽、振蕩培養(yǎng)箱、凈化工作臺、高壓滅菌鍋

3.3．大腸桿菌培養(yǎng)基：

LB培養(yǎng)基（1L）：10g NaCl，10g胰蛋白胨，5g酵母浸粉，加去離子水至1L。

TB培養(yǎng)基（1L）：將12g胰蛋白胨，24g酵母浸粉，4mL甘油溶于900mL去離子水中，各組分溶解后高壓滅菌，冷卻至60°C左右，再加100mL滅菌的17mM KH2PO4和72mM K2HPO4的溶液（2.31gKH2PO4和12.54gK2HPO4）

3.4．抗生素儲備液

卡納霉素儲備液：用無菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素（kanamycin，簡稱Kan）溶液，分裝，-20°C保存?zhèn)溆?。使用時每毫升培養(yǎng)基加入3~5mL，終濃度為30~50mg/mL。

4.實驗流程

4.1.活化菌種：取保藏的工程菌菌種10 μl接入裝有5 ml的LB液體培養(yǎng)基的試管（不同的藻膽蛋白生物合成需要不同的抗生素）中，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)8-12小時。

4.2.擴大培養(yǎng)：將試管中活化的1 ml菌液接種到250 ml LB培養(yǎng)基，同時加入對應(yīng)的抗生素，培養(yǎng)基于37°C搖床振蕩培養(yǎng)。

4.3.色素蛋白生物合成：工程菌培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.6，10°C水浴中放置1 hr，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，20°C低溫過夜誘導(dǎo)后離心收集細胞，二次蒸餾水洗兩次。

4.4．離心：把菌體從發(fā)酵液里離心出來。

第一次離心

（1）首先電子秤取50g菌液到離心管內(nèi)

（2）將離心管放入離心機中

第二次離心

讓菌泥集中到一塊兒，方便取上清液

4.5.光譜分析 吸收光譜用紫外可見光譜儀，紫外可見光譜掃描范圍300~800nm，掃描速度960nm/min，狹縫寬度1.0nm。熒光光譜用熒光光譜儀，熒光光譜掃描速度1200nm/min ，狹縫寬度5.0nm。

 結(jié)果分析

1. 在第一次離心后大腸桿菌菌落呈現(xiàn)藍色和紅色

2.第二次離心后得到更為明顯的紅藍清液

3.吸收和熒光圖譜

藻藍膽素在酸性甲醇溶液中，于680 nm 處的吸收峰是藻藍膽素的特征吸收峰，藻紅膽素在酸性甲醇溶液中，于440nm處的吸收峰是藻紅膽素的特征吸收峰。

實驗總結(jié)

本實驗主要研究的是如何從大腸桿菌中提取藻膽色素。藻膽色素既可作為抗氧化劑應(yīng)用于食品、保健品領(lǐng)域，又可作為熒光探針應(yīng)用于疾病診斷和光學(xué)治療領(lǐng)域，另外藻膽素還能夠有效地減少肝損傷，促進肝細胞的增殖。藻膽素在細胞或者生命體內(nèi)還可以被還原為一種類似于膽紅素的物質(zhì)，能夠有效地抑制 NADPH氧化酶的活性，進而可以減少或治療某些NADPH酶導(dǎo)致的疾病，因此藻膽色素具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)市場價值。